低温胁迫是影响宜昌橙（Citrus ichangensis）产量和品质的重要限制因素。近期，华中农业大学刘继红教授团队在期刊Plant Biotechnology Journal（IF=10.5)发表一项研究，通过DAP-seq和RNA-seq揭示了通过调控CiCAD7介导的桔皮素生物合成和CiGSTF6依赖的ROS清除来调节抗寒性，此外，CiWRKY27还与受其调控的CiRAP2.7蛋白相互作用，形成一个关键的抗寒调控模块。为深入了解低温胁迫下桔皮素生物合成和ROS稳态的分子调控机制提供了有价值的信息，为柑橘等作物抗寒性的改良提供了有前景的分子模型。爱基百客为该研究提供DAP-seq的技术支持。
研究结果
1. 过表达CiWRKY27基因提高转基因植物的耐冷性
作者首先通过亚细胞定位、酵母细胞激活报告基因表达、双荧光素酶验证发现表明CiWRKY27是具有转录激活活性的冷诱导的核定位蛋白。为了进一步探索CiWRKY27在耐冷性中的功能，作者在抗寒性较差的柠檬中过表达CiWRKY27基因。正常生长时，转基因植株与野生型无差异，但在-2℃和-4℃低温胁迫后，转基因株系表现出更高的叶绿素荧光（Fv/Fm）（图1a，b，c），同时电解质渗漏和丙二醛含量显著降低。这些生理指标证明，CiWRKY27的过表达有效增强了柠檬的耐冷性（图1d，e）。
图1 过表达CiWRKY27增强转基因柠檬的耐冷性
2. 通过转录组和DAP-Seq分析鉴定CiWRKY27靶基因
为了更深入地理解冷胁迫应答的分子机制并鉴定由CiWRKY27调节的靶基因，对CiWRKY27沉默（VIGS）植株与对照进行RNA-seq比较分析，揭示了该转录因子在冷胁迫响应中的调控网络。在-4℃处理8小时后，VIGS植株中共鉴定出9911个差异表达基因（DEGs）（图2b），其中2353个基因的表达因低温发生显著改变。进一步分析发现，这2353个基因中有1319个在其启动子区含有WRKY转录因子的典型结合元件W-box，提示它们可能是CiWRKY27的直接调控靶标。功能富集分析显示，这些潜在靶基因显著参与“MAPK信号通路”、“植物激素信号转导”、“昼夜节律”等关键生物过程。GO分析进一步表明，它们主要与“膜的内在组分”和“植物型细胞壁组织”等功能相关（图2 e，f）。这些结果共同揭示了CiWRKY27可能通过调控细胞壁和细胞膜相关的保护性通路，在植物耐冷性中发挥核心作用。
为了进一步了解CiWRKY27介导的耐冷性的转录调控机制，作者用DAP-seq在全基因组范围内鉴定了转录因子CiWRKY27的结合位点。测序获得5018万条高质量读数，定位到18164个富集峰，对应11352个潜在靶基因。结合位点大小在165-2048 bp之间，主要富集在转录起始位点（TSS）附近，其中18.37%位于启动子区（TSS上游2 kb内）（图3a）。基序分析发现了三个富集的DNA结合基序，其中最主要的基序包含WRKY家族典型识别的核心序列“TTGA(C/T)”，证实了CiWRKY27结合的特异性。KEGG分析显示，这些靶基因显著参与“MAPK信号通路”、“植物激素信号转导”等与胁迫响应相关的通路。整合DAP-seq与前期冷胁迫下的RNA-seq数据，筛选出717个重叠基因（图3d），它们很可能是CiWRKY27的直接调控靶标。作者特别关注了两个受冷诱导且在CiWRKY27沉默植株中表达显著下调的功能基因：谷胱甘肽S-转移酶F6(CiGSTF6)和肉桂醇脱氢酶7(CiCAD7)（图3f-i）。这表明CiWRKY27可能通过直接激活这些在细胞保护和抗逆中起关键作用的基因，来正向调控植物的耐冷性。
图2 CiWRKY27调节基因的转录组谱
图3 基于 DAP-seq 技术的CiWRKY27结合位点全基因组鉴定
3. CiWRKY27通过直接结合启动子激活CiGSTF6和CiCAD7
基于DAP-seq数据，研究发现CiWRKY27在CiGSTF6和CiCAD7的启动子区域存在显著结合峰（图4a，b）。为验证其直接结合，作者进行了酵母单杂交实验，结果表明CiWRKY27能够与这两个基因的启动子片段在体内发生特异性相互作用（图4 e，f）。同时，通过EMSA实验证明重组CiWRKY27蛋白能够导致含W-box的启动子DNA片段发生条带迁移，该迁移可被未标记的同源竞争片段剂量依赖性抑制（图4g，h）；而将启动子中的W-box核心基序突变后，CiWRKY27的结合能力完全丧失，证明了结合的序列特异性。最终，双荧光素酶报告基因实验，证实CiWRKY27的表达能显著激活由CiGSTF6或CiCAD7启动子驱动的荧光素酶活性，且该激活效应严格依赖于启动子中完整的W-box基序（图4 i，j，k，l）。这表明了CiWRKY27通过特异性识别并结合CiGSTF6与CiCAD7启动子区的W-box顺式作用元件，直接激活它们的转录表达。这两个关键功能基因的上调，很可能是CiWRKY27增强植物耐冷性的核心分子途径之一。
图4 CiWRKY27直接结合并激活CiGSTF6和CiCAD7的启动子
4. CiWRKY27调节桔皮素生物合成和ROS清除
基于CiCAD7是CiWRKY27的直接靶基因，作者进一步探讨了其对桔皮素合成及耐寒性的调控。与野生型相比，CiWRKY27过表达植株茎中的桔皮素积累（间苯三酚-HCl染色）、CAD酶活性及桔皮素含量均显著增加。相反，在CiWRKY27沉默的VIGS植株中，这些指标则显著降低（图5）。结果表明，CiWRKY27通过上调CiCAD7的表达，促进桔皮素合成，从而增强植物的耐寒性。
图5 CiWRKY27调节桔皮素生物合成和ROS清除促进抗寒性
5. CiCAD7和CiGSTF6在调节耐寒性中的正向功能
作者为了验证CiWRKY27下游靶基因的功能，研究分别构建了CiCAD7和CiGSTF6的VIGS沉默植株。耐冷性评估表明，与对照相比，这两种沉默植株在低温胁迫下均表现出更严重的叶片损伤、更低的叶绿素荧光（Fv/Fm）、以及更高的电解质渗漏和丙二醛含量。此外，CiCAD7沉默植株的桔皮素含量显著降低（图6）。结果证实，CiCAD7和CiGSTF6均正向调控植物的耐冷性，其作用机制分别与促进桔皮素生物合成和清除活性氧（ROS）相关。
图6 CiCAD7和CiGSTF6在抗寒性的调节中起积极作用
6.CiRAP2.7与CiWRKY27相互作用并受其调节
为了阐明CiWRKY27赋予耐寒性的分子机制，作者通过酵母双杂交筛选，鉴定出AP2/ERF家族转录因子CiRAP2.7是CiWRKY27的主要互作蛋白。该互作关系通过逐点酵母双杂交、双分子荧光互补、荧光素酶互补及体外Pull-down等多种实验得到证实，表明两者在体内外均直接相互作用（图7 d）。通过进一步的功能研究，作者发现，CiRAP2.7能够增强CiWRKY27的转录激活活性：在本氏烟草中共表达CiWRKY27与CiRAP2.7，比单独表达CiWRKY27能更强烈地激活下游靶基因CiCAD7的启动子（图7 e，f）。DAP-seq数据显示CiWRKY27在CiRAP2.7启动子区存在结合峰（图8a）。酵母单杂交、EMSA及双荧光素酶报告基因实验均证实，CiWRKY27能够通过特异性结合CiRAP2.7启动子中最靠近起始密码子的一个W-box基序，直接激活CiRAP2.7的转录（图8b，c，d，e）。综上所述，CiRAP2.7不仅是CiWRKY27的互作蛋白，还受其直接转录调控。两者形成了一个正向调控环路：CiWRKY27直接激活CiRAP2.7的表达，而CiRAP2.7蛋白又反过来增强CiWRKY27的转录活性，共同放大对下游耐冷相关靶基因（如CiCAD7）的激活信号，从而协同增强植物的耐寒性。
图7 与CiRAP2.7的相互作用增强CiWRKY27的转录激活活性
图8 CiWRKY27直接结合并激活CiRAP2.7的启动子
7.CiRAP2.7正向调节耐寒性
作者为研究CiRAP2.7功能，通过RT-qPCR发现其表达受冷诱导。沉默CiRAP2.7的VIGS植株对低温更为敏感，表现为更严重的叶片萎蔫、更低的叶绿素荧光（Fv/Fm）以及更高的电解质渗漏和丙二醛含量（图9）。结果表明CiRAP2.7在植物耐冷性中起正向调控作用。
图9 CiRAP2.7正调控耐寒性
研究结论
该研究通过整合RNA-seq和DAP-seq的数据分析了在宜昌橙冷胁迫反应中的分子机制导致CiWRKY27的激活，其起到CiCAD7和CiGSTF6的上游转录激活因子的作用。CiRAP2.7与CiWRKY27相互作用并通过未知的机制增强其转录激活。同时，CiWRKY27转录调控CiRAP2.7，因此，分子模块CiWRKY27-CiRAP2.7协同作用以调节CiCAD7和CiGSTF6，从而导致CiCAD7和CiGSTF6之间的相互作用。促进了对植物响应冷胁迫过程中桔皮素积累和ROS清除的分子机制的理解，并为探索柑橘抗寒性调控的关键途径提供了有价值的线索。
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