在肿瘤免疫研究的核心战场上，CD8⁺ T细胞扮演着无可替代的"冲锋队"角色。它们是杀伤肿瘤细胞、实现免疫监视的主力军。想要深入探究其功能、开发新型免疫疗法，第一步便是从复杂的肿瘤微环境中，高效、高纯度地获取这群"战斗精英"。传统的流式分选虽精确，但对设备要求高且可能影响细胞活性；而免疫磁珠分选（Magnetic Activated Cell Sorting， MACS）凭借其操作简便、快速温和、分选后细胞活性好等优势，已成为实验室获取CD8⁺ T细胞的黄金标准。
本文将为您系统解析从小鼠肿瘤组织中分选CD8⁺ T细胞的完整磁珠方案，并深入探讨如何优化每一步骤以应对肿瘤样本的特殊挑战，最终为您推荐一款卓越的国产分选工具。
一、分选全流程精解------从肿瘤组织到纯化细胞
成功的分选始于精心准备的样本。对于实体瘤，我们需要经历三大关键阶段。
第一阶段：肿瘤组织单细胞悬液制备------释放细胞"兵团"
目标是将坚实的肿瘤组织转化为游离的单个细胞，同时最大限度保持细胞活性。
组织获取与预处理：处死荷瘤小鼠，无菌取出肿瘤组织，置于预冷的无菌培养皿中。加入少量不含血清的培养基（如RPMI-1640）保持湿润。
机械破碎：使用无菌手术剪或刀片，将组织充分剪碎至1-3 mm³的小块。此步骤旨在增加消化酶的作用面积。
酶学消化：加入配置好的消化酶工作液（通常包含胶原酶IV、DNase I等），其核心作用是分解细胞外基质和切断DNA网络，防止细胞结团。于37℃恒温摇床中消化20-40分钟，期间可轻柔吹打数次。
终止与过滤：加入含血清的完全培养基终止消化。随后，使用70μm细胞滤网研磨并过滤悬液，以去除未消化的组织块和大的团簇。收集滤液，离心并重悬细胞沉淀。
第二阶段：肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）富集------分离精锐"部队"
肿瘤悬液中除了我们需要的淋巴细胞，还包含大量肿瘤细胞、成纤维细胞、死细胞等。通过密度梯度离心（常用Percoll或Ficoll），可以高效富集淋巴细胞群体。
梯度液制备：在离心管底部小心加入高密度（如70%）的Percoll溶液，再在其上层缓慢铺上低密度（如40%）的Percoll细胞悬液，形成清晰界面。
离心富集：在室温下，以适当的离心力（如800 g）离心20-30分钟，关闭刹车（降速DEC 1），保证分层平稳。
细胞收集：离心后，目标淋巴细胞通常位于两层液体的交界处（白膜层）。小心吸取该层细胞，转移至新管中。
清洗与计数：用足量预冷的分选缓冲液（如含0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS）洗涤细胞2次，彻底去除Percoll残留。最后进行细胞计数与活力检测，确保起始细胞活率高于85%，这是获得高得率和高活性分选结果的前提。
第三阶段：CD8⁺ T细胞磁珠阳性分选------锁定最终"目标"
这是利用磁珠特异性捕获目标细胞的核心步骤。我们采用直接阳性分选策略，因其步骤最简、回收率最高，尤其适用于从肿瘤这类复杂样本中获取CD8⁺ T细胞。
阻断非特异性结合（关键步骤！）：将细胞重悬于适量分选缓冲液中。每1×10⁷个细胞加入2-5 μL的Fc受体阻断剂，冰上孵育5-10分钟。这一步能极大减少磁珠通过Fc段与非目标细胞（如巨噬细胞、单核细胞）的非特异性结合，是保证高纯度的关键。
磁珠标记：按照产品说明书推荐比例（例如，每1×10⁷总细胞加入20 μL CD8a特异性磁珠）加入磁珠，轻柔混匀。在2-8℃下避光孵育15-20分钟。全程低温操作可降低细胞代谢和抗体/磁珠的非特异性内吞。
预过滤：标记后的细胞悬液使用30-40 μm的预分离滤器过滤，以去除可能堵塞分选柱的细胞团块。
上柱分选：
润洗柱子：将合适规格的分选柱（如LS柱）置于强磁场中，用3 mL预冷分选缓冲液润洗。
上样与洗涤：将细胞悬液上柱，收集流穿液（此为CD8⁻细胞）。用缓冲液洗涤分选柱3次，每次3 mL，充分洗去未结合的细胞。
洗脱目标细胞：将分选柱移出磁场，置于新的收集管上。加入适量缓冲液（如5 mL），用配套柱塞迅速推挤，洗脱得到高纯度的CD8⁺ T细胞。
分选结束后，建议立即取样，通过流式细胞术检测CD3⁺CD8⁺双阳性细胞的占比以评估分选纯度，并计算分选得率（分选后目标细胞数/分选前样本中目标细胞数）。
二、攻克难点与策略优化------让分选事半功倍
肿瘤样本有其特殊性，以下策略能帮助您应对挑战：
应对低活率与细胞脆弱：全程使用预冷的缓冲液和低温操作环境（冰上或4℃冰箱）。消化时间需根据肿瘤类型优化，避免过度。分选缓冲液中添加BSA和EDTA能保护细胞并防止粘连。
应对杂质细胞过多：若TIL富集后杂质仍多，可考虑采用顺序分选策略。例如，先使用含有针对CD11b、CD19、CD49b等非T细胞标志抗体的阴性分选试剂盒去除髓系细胞、B细胞、NK细胞等，再对剩余的富集淋巴细胞进行CD8阳性分选，可显著提高最终产物的纯度。
确保高回收率与活性：严格按照磁珠说明书推荐的细胞量与磁珠比例操作，避免柱子过载。洗脱时动作迅速，减少目标细胞在柱内的滞留时间。分选后的细胞应尽快用于后续实验或置于含血清的完全培养基中恢复培养。
