《AJRCCM》(IF: 21.7)｜空间单细胞蛋白组揭示EGFR/KRAS突变特异的免疫生态位与NSCLC预后标志物

仅约20%的非小细胞肺癌（NSCLC）患者能从免疫治疗中获益，这一困境的核心在于我们对癌基因突变如何"重塑"肿瘤微环境（TME）空间架构的理解严重不足。EGFR突变肿瘤（常见于非吸烟者）对免疫检查点抑制剂（ICI）反应极差，而KRAS突变肿瘤（常见于吸烟者）虽携带更高肿瘤突变负荷（TMB）和PD-L1表达，免疫治疗反应仍高度异质。虽然单细胞转录组揭示了TME的细胞多样性，但丢失了免疫-肿瘤互作中至关重要的空间维度——免疫细胞在"何处"与肿瘤细胞相遇，往往比"有多少"免疫细胞更能决定免疫应答的命运。近期，《American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine》（AJRCCM）发表了一篇题为"Spatial proteomics profiling reveals oncogene-specific immune niches and prognostic markers in NSCLC"的研究论文，首次构建了基于驱动突变分层的NSCLC空间单细胞图谱。

该研究利用PhenoCycler-Fusion（PCF，即CODEX）空间单细胞蛋白质组平台，采用41-plex多重抗体组合，对197例NSCLC FFPE肿瘤组织芯片（TMA）进行单细胞分辨率空间成像，系统解析了EGFR突变（50例）、KRAS突变（50例）与野生型（WT，97例）肿瘤的TME空间架构差异。

PCF(CODEX)注释超过200万个单细胞，鉴定出14种细胞表型（肿瘤细胞、增殖性肿瘤细胞、凋亡性肿瘤细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、M1样TAMs、M2样TAMs、树突状细胞、粒细胞、B细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞、T-regs），并结合细胞邻域（Cellular Neighborhood, CN）、最近邻距离（k-Nearest Neighbor, kNN）和空间邻近度（Proximity Analysis, 25/50/100 μm）三种空间分析框架，全面解码了突变特异性的空间免疫生态位。

发现一：EGFR和KRAS突变均塑造"免疫荒漠化"的TME，但免疫抑制机制截然不同

细胞组成分析揭示，EGFR突变和KRAS突变肿瘤的肿瘤细胞密度远高于WT，而免疫浸润被显著压缩。两种突变肿瘤的淋巴细胞和髓系细胞均大幅减少，其中细胞毒性T细胞、树突状细胞和粒细胞耗竭最为明显。然而，巨噬细胞极化方向呈现突变特异性差异：EGFR突变肿瘤中M2样肿瘤相关巨噬细胞（M2-TAMs）显著富集，而KRAS突变肿瘤的TAM总丰度较低。这意味着EGFR突变肿瘤主要通过M2型免疫抑制重塑TME，而KRAS突变肿瘤则更偏向整体免疫排斥。值得注意的是，KRAS/STK11或KRAS/KEAP1共突变肿瘤的M1-TAMs和平滑肌细胞进一步减少，呈现更强的免疫抑制表型；EGFR/TP53共突变则与M1-TAMs增加相关。

KRAS突变亚型进一步细分分析揭示，KRAS G12D突变肿瘤的凋亡肿瘤细胞更少、树突状细胞更多，与G12C/G12V等其他亚型呈现不同的免疫表型。这提示未来KRAS靶向治疗（如G12C抑制剂）的联合免疫治疗策略可能需要考虑不同突变亚型的TME差异。

发现二：14种细胞邻域（CNs）揭示突变特异性空间生态位

CN分析鉴定出14种可重复出现的细胞邻域（CN1-CN14）。KRAS突变肿瘤富集于肿瘤主导型邻域、增殖性肿瘤细胞邻域和成纤维细胞邻域；EGFR突变肿瘤除肿瘤主导型邻域外，最显著的特征是M2-TAMs富集邻域CN7的高度富集。与之形成鲜明对比的是，WT肿瘤富含免疫活跃型邻域，包括M1-TAMs相关CN、内皮细胞CN、细胞毒性T细胞CN、辅助T细胞CN和粒细胞CN。这些结果表明，癌基因突变并非简单地"减少"免疫细胞，而是重新编程了TME的空间生态位组成，EGFR突变尤以M2-TAMs为核心构建了一个免疫抑制性空间"堡垒"。

发现三：最近邻距离分析揭示免疫排斥的空间新机制

最近邻距离分析带来了一个反直觉的发现：虽然WT肿瘤整体免疫浸润最多，但WT肿瘤中肿瘤细胞与多种免疫细胞的距离反而最大。这揭示了一种此前未被充分认识的"免疫排斥"模式——WT肿瘤的免疫细胞可能被隔离在肿瘤外围基质区域，无法有效接触肿瘤细胞。在EGFR突变肿瘤中，细胞毒性T细胞与增殖性肿瘤细胞的距离增大、树突状细胞与多种细胞类型的距离也增大，这从空间维度解释了EGFR突变肿瘤的抗原呈递缺陷和T细胞效应功能受损。这些空间距离的差异主要集中在短距离尺度（5/10-NN），在20-NN层面趋于减弱，表明癌基因突变对TME空间组织的影响是局部微环境级别的精细调控。

发现四：空间邻近度分析揭示免疫-肿瘤功能互作的突变特异性特征

以肿瘤细胞为中心的空间邻近度分析（25-100 μm）显示，KRAS突变肿瘤的T-regs、M1-TAMs、增殖性肿瘤细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞在肿瘤周围显著富集；EGFR突变肿瘤同样富集T-regs和增殖性肿瘤细胞，但凋亡肿瘤细胞减少。进一步分析免疫细胞对肿瘤功能状态的影响发现：两种突变肿瘤的增殖性肿瘤细胞均富集于T-regs和平滑肌细胞附近，提示T-regs不仅抑制抗肿瘤免疫，还可能直接或间接促进肿瘤增殖。在EGFR突变肿瘤中，凋亡肿瘤细胞较少出现在细胞毒性T细胞、辅助T细胞和T-regs附近，表明免疫杀伤功能被系统性削弱。

发现五：空间免疫架构是超越传统标志物的预后预测因子

将空间分析指标与临床预后整合是这项研究最具临床转化价值的部分。多变量Cox回归模型揭示了一系列突变特异性的空间预后规律：

EGFR突变肿瘤的空间预后特征：

（1）肿瘤-内皮细胞靠近 →预后更差（提示EGFR驱动的VEGF血管重塑促进免疫抑制）

（2）肿瘤-M2-TAMs/粒细胞靠近 → 预后趋向更差

（3）肿瘤-细胞毒性T细胞/树突状细胞/成纤维细胞靠近 → 预后趋向更好

（4）凋亡肿瘤细胞与辅助T细胞在50μm内靠近 →预后更差（反映功能失调的免疫激活）

KRAS突变肿瘤的空间预后特征：

（1）肿瘤-细胞毒性T细胞靠近 →预后更差（T细胞功能耗竭的空间证据）

（2）肿瘤-内皮细胞靠近 →预后更好（与EGFR突变截然相反）

（3）肿瘤-TAMs/B细胞/DCs/成纤维细胞靠近 → 预后趋向更差

（4）M1-TAMs在25-100μm范围内靠近肿瘤 →预后更好（M1-TAMs抗肿瘤功能的空间证据）

（5）凋亡肿瘤细胞与粒细胞、M1-TAMs、平滑肌细胞靠近 →预后更差（促炎微环境的有害效应）

这些发现确立了一个核心论点：免疫细胞的空间定位和邻域关系，而非其单纯的丰度，是决定NSCLC预后的关键因子。在KRAS突变肿瘤中，细胞毒性T细胞靠近肿瘤反而预示更差预后这一反直觉发现，为理解KRAS突变肿瘤中T细胞的功能耗竭状态提供了空间维度的解释，也部分说明了为何此类患者对PD-1/PD-L1抑制剂的反应高度异质。

本研究建立了大规模的NSCLC空间单细胞蛋白组图谱，并提出了多项具有临床转化潜力的方向：第一，空间免疫特征有望作为超越PD-L1和TMB的精准分层工具，特别是在PD-L1阴性或TMB低且现有标志物失效的亚组中。第二，EGFR突变肿瘤中M2-TAMs主导的CN7免疫抑制生态位为联合ICI与巨噬细胞重编程治疗提供了明确的靶向空间依据。第三，KRAS突变肿瘤中细胞毒性T细胞的功能耗竭空间特征支持将T细胞"再激活"策略（如联合LAG3/TIGIT抑制）与KRAS抑制剂联用。第四，突变-空间生态位-预后三者关系的阐明为"突变导向的空间免疫治疗策略"提供了理论基础。

| 参考文献

Nandigama R, Ben Cheikh B, Wilhelm J, et al. Spatial proteomics profiling reveals oncogene-specific immune niches and prognostic markers in NSCLC. Am J Respir Crit Care Med. 2026:aamag330.

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