蛋白磷酸化是生命科学中最核心的翻译后修饰之一，堪称细胞信号转导的“分子开关”。在真核生物中，约30%的蛋白质可被磷酸化修饰，这一修饰调控着细胞增殖、分化、凋亡、代谢等几乎一切生命活动。当激酶将ATP的磷酸基团转移至底物蛋白的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上时，底物的活性、稳定性、互作能力都可能发生翻天覆地的变化。因此，验证激酶-底物关系并精确定位磷酸化位点，是理解信号通路调控机制的关键一步。
那么，如何严谨地证明激酶A能够直接磷酸化底物B，并找到具体是哪个氨基酸被修饰？体外磷酸化实验（In vitro kinase assay）是最直接、最权威的验证手段。
一、体外磷酸化的“不可替代性”
与体内磷酸化验证相比，体外磷酸化实验使用纯化的重组蛋白在试管中重构磷酸化反应，具有三大核心优势：
1.直接证据：体内实验只能证明“在细胞里A存在时B被磷酸化了”，但可能存在中间蛋白的介导。体外实验用纯化的A和B直接反应，能一锤定音地证明A就是B的直接激酶。
2.条件可控：反应时间、温度、ATP浓度、离子条件均可精确调控，结果重复性高。
3.位点精准定位：结合点突变体（如将候选丝氨酸突变为丙氨酸的S→A突变体）进行平行反应，可直接验证特定氨基酸是否为磷酸化受体位点。
二、实验设计与流程
1、Pull-down体外验证
首先需要体外验证激酶A与底物B是否存在互作，激酶A与底物B存在互作是激酶A可以把底物B磷酸化的前提。
2、体外磷酸化实验
（1）分组设计
①对照组：空标签(激酶A的标签)+底物B；
②对照组：激酶A+空标签(底物B的标签)；
③实验组：激酶A+底物B；
④λ-磷酸酶组（可选）：激酶A+底物B+λ-PPase。
λ-磷酸酶（Lambda Phosphatase, λ-PPase）是广谱丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷酸酶，可以非特异性地将蛋白上已经磷酸化的丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基上的磷酸基团（-PO₄³⁻）水解掉（去磷酸化）。
（2）体外磷酸化反应体系
①反应体系优化标准激酶缓冲液：20mM Tris-HCl (pH 7.5)，5mM MgCl₂，5mM MnCl₂，2mM DTT；
②ATP浓度：10μM；
③反应条件：30℃孵育30分钟。
（3）WB验证
通过激酶A和底物B的标签抗体（或A与B特异性抗体）、及泛磷酸化抗体进行WB检测，看底物B是否发生磷酸化。
3、磷酸化位点鉴定
（1）质谱鉴定
磷酸化反应结束后，向反应体系中加入蛋白上样缓冲液（loading buffer）然后进行SDS-PAGE电泳，切割目的条带进行质谱鉴定磷酸化位点。
（2）构建突变体
对于质谱鉴定的磷酸化位点，可以构建相应底物B的突变体，通过对比底物B WT野生型和MUT突变型的体外磷酸化结果，进一步验证磷酸化位点。
三、案例分享
小医给大家分享两篇经典的体外磷酸化及位点验证的文献案例。
1、案例一：质谱鉴定+特异性磷酸化抗体检测
这篇案例采用了“激酶-底物验证”的完整逻辑链——先证明“能结合”，然后证明“能磷酸化”，且精确定位到Ser727位点，为后续LATS1/2通过磷酸化STAT1上调MHC-I的细胞功能实验奠定了坚实的分子基础。实验流程如下：
（1）证明激酶与底物能结合（图1F）：使用纯化的重组蛋白进行体外结合实验。GST-STAT1融合蛋白（而非GST对照）能够将His-LATS1或His-LATS2从溶液中拉下来，证明LATS1/2与STAT1之间存在直接的物理相互作用，无需其他介导蛋白。
（2）体外磷酸化+质谱鉴定(图1G-H)：将纯化的活性LATS2激酶与STAT1的不同片段（1–650 aa和650–750 aa）在含ATP的缓冲液中孵育，随后对反应产物进行质谱鉴定。质谱谱图明确显示LATS2能够直接磷酸化STAT1的Ser532和Ser727两个位点。
（3）体外磷酸化+特异性磷酸化抗体(图1I-J)：使用商业化的anti-phospho-STAT1(Ser727)特异性抗体进行WB检测。结果显示，活性LATS2和LATS1均能使STAT1的Ser727发生磷酸化（磷酸化抗体显色），而GST对照或无激酶组无信号。这进一步验证了质谱结果，确认了Ser727是LATS1/2在STAT1上的磷酸化位点。
图1 验证LATS1/2可催化STAT1蛋白磷酸化（Yang et al., 2025）。
2、案例二：构建突变体验证磷酸化位点
这篇案例增加了λ-磷酸酶处理，加强验证了AKT1是TRPML1的直接激酶。实验流程如下：
（1）将纯化的重组TRPML1蛋白作为底物，与重组活化的AKT1激酶在含ATP的激酶缓冲液中于30°C孵育0.5小时。图2G结果显示AKT1能直接在TRPML1上催化添加磷酸基团。尤为严谨的是，实验设置了λ-磷酸酶处理组——这种广谱磷酸酶能特异性地切除已连接的磷酸基团，结果磷酸化信号随之消失，从而严格排除了非特异性结合或背景干扰，确证了磷酸化修饰的真实性。
(2)研究者将野生型TRPML1（WT）与磷酸化缺失突变体TRPML1-S343A（将第343位丝氨酸突变为丙氨酸，使其无法被磷酸化）进行平行体外激酶反应。图2I结果显示：野生型组呈现强烈的磷酸化条带，而S343A突变体组的信号几乎完全消失。
图2 体外磷酸化实验验证AKT能磷酸化TRPML1（Zhang et al., 2024）。
四、总结
体外磷酸化实验对蛋白样品的纯度和活性要求极高。常见的风险包括：
①原核表达不表达或表达量低（跨膜蛋白尤其困难），需优化条件重复尝试；
②激酶与底物在体外不互作（可能是因为缺乏辅助因子或构象差异）；
③质谱鉴定不到磷酸化位点（可能是磷酸化修饰的蛋白数量占比太低）。
蛋白磷酸化是解锁细胞信号奥秘的钥匙，而体外磷酸化实验正是打造这把钥匙的精密工具。从激酶-底物关系的直接验证，到磷酸化位点的精确定位，希望这套方法学能为您的研究设计提供有价值的参考！
参考文献
Yang Q, Lv Z, Wang M, et al. LATS1/2 loss promote tumor immune evasion in endometrial cancer through downregulating MHC-I expression[J].Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2024, 43(1): 54.
Zhang HL, Hu BX, Ye ZP, et al. TRPML1 triggers ferroptosis defense and is a potential therapeutic target in AKT-hyperactivated cancer[J].Science Translational Medicine,2024, 16(753): eadk0330.
