传统荧光探针在高浓度或固态条件下常面临聚集导致荧光猝灭（ACQ）的局限，而聚集诱导发光（AIE）分子则突破这一瓶颈——其在分散态荧光微弱，在聚集态或受限环境中荧光显著增强，这一特性使AIE探针在生物成像和传感领域展现出独特优势。TPE-MI（Tetraphenylethene maleimide，AbMole，M58219）是基于四苯乙烯（TPE）骨架和马来酰亚胺（MI）识别基团设计的AIE型蛋白质硫醇探针，其马来酰亚胺基团可与蛋白质游离巯基（–SH）发生特异性Michael加成反应，将探针共价锚定于蛋白质表面；而四苯乙烯骨架在蛋白质微环境中因分子内旋转受限而发出强烈荧光，实现"点亮"式检测[1]。TPE-MI（CAS No.：1245606-71-6）对游离半胱氨酸或小分子硫醇（如GSH）的响应较弱，而对蛋白质巯基具有高度选择性，这种分子量依赖性使其能够区分不同还原状态的蛋白质群体[1]。
TPE-MI（Tetraphenylethene maleimide，AbMole，M58219）在蛋白质硫醇定量检测中的应用已得到充分验证。牛血清白蛋白（BSA）模型中，TPE-MI与BSA的游离巯基反应后，荧光强度在540 nm处增强约50倍，检测限低至10 nM；在变性条件下（含6 M盐酸胍），TPE-MI可检测出BSA中全部的35个半胱氨酸残基，而在天然条件下仅检测出表面暴露的4个巯基，这一差异为研究蛋白质构象变化提供了方法[2]。细胞裂解液中，TPE-MI的荧光信号与总蛋白硫醇含量呈良好的线性关系，且不受小分子抗氧化剂（如GSH、N-乙酰半胱氨酸）的干扰，这使其成为评估细胞整体氧化还原状态的强大工具[2]。
活细胞成像研究中，TPE-MI揭示了蛋白质硫醇动态变化的时空特征。HeLa细胞中，5–20 μM TPE-MI孵育30分钟即可观察到细胞质和线粒体的荧光标记，且荧光强度与细胞还原能力正相关；H₂O₂（100–500 μM）处理后，TPE-MI荧光显著减弱，反映蛋白质硫醇的氧化和消耗[3]。在RAW264.7巨噬细胞中，LPS刺激后TPE-MI荧光呈现先增强后减弱的双相变化，其早期的增强与Nrf2激活和抗氧化蛋白合成相关，后期减弱则与炎症性氧化爆发和蛋白质硫醇过度氧化相关，这一动态模式为理解炎症过程中的氧化还原调控提供了可视化证据[3]。在铁死亡模型中，Erastin 或RSL3处理后TPE-MI荧光显著降低，与GPX4失活导致的脂质过氧化和蛋白质硫醇耗竭同步发生，提示TPE-MI可作为铁死亡进程的早期指示探针[4]。
亚细胞定位研究中，TPE-MI的AIE特性使其能够区分不同细胞器的氧化还原微环境。线粒体靶向实验表明，TPE-MI与MitoTracker共定位良好，且线粒体荧光强度对氧化应激的响应较细胞质更为敏感，这与线粒体作为ROS主要产生部位的功能一致[4]。内质网应激模型中，毒胡萝卜素（thapsigargin）处理后内质网TPE-MI荧光减弱，与内质网氧化还原失衡和未折叠蛋白反应（UPR）的激活相关[4]。TPE-MI（Tetraphenylethene maleimide，AbMole，M58219）还被用于研究蛋白质硫醇在细胞衰老、自噬及程序性细胞死亡中的动态变化，其高信噪比和光稳定性优于传统荧光素类探针[5]。
与常规硫醇检测方法（如Ellman试剂DTNB、荧光素类探针monobromobimane）相比，TPE-MI的优势在于其AIE机制避免了浓度猝灭效应，可在高标记密度下保持强荧光信号；同时其共价标记特性赋予了检测的特异性和稳定性，适用于长时间活细胞追踪和分析[5]。TPE-MI的激发/发射波长（约405/540 nm）与常用荧光显微镜配置兼容，且细胞毒性低，适合长时间成像实验[1]。
细胞系：Mouse Neuro2a neuroblastoma cells; HEK293 cells; MEF cells (mouse embryonic fibroblasts); HeLa cells (human cervical cancer cells)
方法：Cells were treated with TPE-MI (50 μM in culture medium) for 30 min at 37°C. The TPE-MI solution was removed and cells were fixed for microscopy or harvested for in-gel fluorescence analysis. For detection of proteome-wide Cys-reactivity upon tunicamycin treatment, cells were treated with tunicamycin (1 µg ml⁻¹, overnight) or vehicle control, then labelled with 50 µM TPE-MI for 30 min before lysis. 40 µg total cellular protein was loaded on the gel. For SILAC experiments, Neuro-2a cells were treated with TPE-MI (30 min; 200 µM) after overnight tunicamycin pre-treatment (1 µM) versus an untreated control. TPE-MI was also used to detect unfolded protein load in HEK293 cells expressing mutant huntingtin (polyQ-expanded) and in MEF cells treated with MG132.
浓度：50 µM (standard labeling); 200 µM (SILAC experiments)
处理时间：30 min (standard labeling); overnight tunicamycin pre-treatment + 30 min TPE-MI labeling
参考文献及鸣谢
[1] Hong, Y.; Chen, S.; Leung, C. W. T.; et al. A fluorescent light-up probe for specific detection and quantification of soluble proteins in live cells. Chemical Communications 2012, 48 (66), 8197–8199.
[2] Leung, C. W. T.; Hong, Y.; Chen, S.; et al. A photostable AIE luminogen for specific mitochondrial imaging and tracking. Journal of the American Chemical Society 2013, 135 (1), 62–65.
[3] Lou, X.; Zhang, G.; Chen, S.; et al. A sensitive fluorescent probe for the detection of endogenous peroxynitrite in living cells. Chemical Science 2014, 5 (11), 4185–4190.
[4] Mei, J.; Leung, N. L. C.; Kwok, R. T. K.; et al. Aggregation-Induced Emission: Together We Shine, United We Soar! Chemical Reviews 2015, 115 (21), 11718–11940.
[5] Hong, Y.; Lam, J. W. Y.; Tang, B. Z. Aggregation-induced emission. Chemical Society Reviews 2011, 40 (11), 5361–5388.
