EviAnn v2.0.5 安装与使用--生信工具111-育师

EviAnn—— 基于证据的真核生物基因组注释软件

EviAnn（Evidence Annotation）是一款全新的基因组注释软件，完全基于证据驱动。EviAnn 利用 RNA‑seq 数据、转录本序列以及近缘物种蛋白比对结果，完成蛋白编码基因与长非编码 RNA 的注释，输出 GFF3 格式注释文件。运行 EviAnn不需要预先对基因组重复序列进行软屏蔽；软件运行稳定、速度快。在一台 24 核 Intel Xeon Gold 服务器上，完成小鼠（M. musculus）基因组注释耗时不到 1 小时（输入为比对完成的 RNA‑seq BAM 文件，以及包含人在内的多个近缘物种合计约 346 Mb 蛋白序列）。

https://github.com/alekseyzimin/EviAnn_release #官网

EviAnn 的优势

输出完全符合 NCBI 注释规范，注释结果可直接通过table2asn工具提交至 NCBI GenBank（见下文）。
安装与运行简单，依赖库易于部署。
运行速度极快：RNA‑seq 比对完成后，哺乳动物基因组注释耗时小于 1 小时。
绝大多数蛋白编码转录本可输出 5' 与 3'UTR。
支持长非编码 RNA（lncRNA）注释。
自动标记加工假基因，并且不输出假基因的 CDS 序列。
可通过参数‑f调用 UniProt‑SwissProt 数据库，实现可选的自动功能注释。
同时支持长读长、短读长转录组数据，也支持混合数据集。
支持最大32 Gbp的基因组。
若存在一个或多个注释完成的近缘物种，DNA 水平平均相似度 > 95% 时，无需 RNA‑seq 数据，仅依靠近缘物种转录本与蛋白即可完成注释。
支持细胞器（线粒体、叶绿体）注释。
支持染色体长度 > 4 Gbp 的超大基因组。

EviAnn 开发得到美国 NSF 基金 IOS‑2432298，以及 NIH 基金 R01‑HG006677、R35‑GM130151 资助。

安装说明

Bioconda 安装

EviAnn 已上架 Bioconda。建议新建独立 conda 环境：

conda create -n eviann

激活环境并安装：

conda activate eviann conda install eviann

安装完成后运行eviann.sh即可使用。切换环境使用：conda activate eviann/conda deactivate。

GitHub 源码安装

从 GitHub 发布页下载最新源码压缩包EviAnn‑X.X.X.tar.gz（不要下载 Source code 源码包）： https://github.com/alekseyzimin/EviAnn_release/releases 将 X 替换为实际版本号，执行：

$ tar xvzf EviAnn-X.X.X.tar.gz $ cd EviAnn-X.X.X $ ./install.sh

安装脚本自动编译配置全部依赖，可执行文件输出至bin/目录。任意位置调用：/path_to/EviAnn‑X.X.X/bin/eviann.sh

外部依赖（GitHub 源码安装需要手动部署至 PATH）

minimap2: https://github.com/lh3/minimap2
HISAT2: https://github.com/DaehwanKimLab/hisat2

软件内置打包的依赖（无需手动安装）

StringTie 3.0.0（静态编译版）
gffread 0.12.7（静态编译版）
gffread 0.12.6（静态编译版）
makeblastdb、blastp 2.8.1+（NCBI 工具；若提示版本不兼容，可从 NCBI FTP 下载旧版本）
TransDecoder 5.7.1（修改版，移除 URI::Escape 依赖）
samtools 1.15.1（静态编译版）
ufasta 1.0（安装时编译）
miniprot v0.15‑r270（安装时编译）

开发者模式（仅开发人员使用）

克隆开发分支需要额外依赖：swig、yaggo，需要配置到系统 PATH。

$ git clone https://github.com/alekseyzimin/EviAnn_release $ cd EviAnn_release $ git submodule init $ git submodule update $ cd ../ufasta && git checkout master $ cd .. $ make $ (cd build/inst/bin && tar -xzf TransDecoder-v5.7.1.tar.gz) $ (cd build/inst/bin && tar -xzf miniprot.tgz && cd miniprot_source && make && mv miniprot ../ && cd .. && rm -rf miniprot_source miniprot.tgz)

编译：执行make；生成发布包：make install；二进制输出目录build/inst/bin；版本号在 Makefile 头部设置。

部分系统编译报错：缺失xlocale.h，glibc 2.26 之后移除该头文件。EviAnn 的 Perl 扩展模块依赖该文件。解决方案：升级 Perl 扩展，或者建立软链接：

ln -s /usr/include/locale.h /usr/include/xlocale.h

使用命令

eviann.sh [options]

参数说明

参数	说明
`‑t INT`	线程数，默认：1
`‑g FILE`	必填：基因组 fasta 文件，无默认值
`‑r FILE`	转录组测序数据文件列表，无默认值文件格式说明：每行对应一个测序样本；一个样本的所有 reads 放在同一行。格式示例：`/path/file1 /path/file2 /path/file3 tag/path/file1 /path/file2 tag/path/file1 tag`空格分隔，行首无空格；tag 说明数据类型：`fastq`：Illumina RNA‑seq fastq；输入 1 个或一对 fastq`fasta`：Illumina RNA‑seq fasta；输入 1 个或一对 fasta`bam`：比对完成的 Illumina RNA‑seq bam`bam_isoseq`：比对完成的 PacBio Iso‑seq bam`isoseq`：PacBio Iso‑seq fasta/fastq`mix`：同一样本同时包含 Illumina (fastq)+ 长读长 (Iso‑seq/ONT)，输入 3 个文件`bam_mix`：同一样本同时包含 Illumina (bam)+ 长读长 (bam)，输入 2 个 bam不写 tag 默认视为`fastq`，需要 1 个或一对 fastq 文件。
`‑e FILE`	近缘物种组装转录本 fasta，用作注释证据，默认无
`‑p FILE`	近缘物种蛋白序列 fasta（建议≥10 个物种）；不提供则自动调用 uniprot 蛋白，默认无
`‑s FILE`	UniProt‑SwissProt 蛋白 fasta，用于功能注释；软件会自动下载最新版本；指定该参数可使用本地版本；数据库地址：https://ftp.uniprot.org/pub/databases/uniprot/current_release/knowledgebase/complete/uniprot_sprot.fasta.gz
`‑m INT`	最大内含子长度；默认自动计算：`sqrt(基因组kb大小)*1000`
`‑‑partial`	输出包含 CDS 不完整（缺失起始 / 终止密码子）的转录本
`‑d INT`	基因组倍性，用于估算最大内含子长度，默认 2
`‑c FILE`	本物种 CDS 的 GFF 文件作为注释输入；GFF 必须包含 gene/transcript/mRNA/exon/CDS 层级
`‑‑lncrnamintpm FLOAT`	lncRNA 注释最低 TPM 阈值，默认 1.0
`‑f\|‑‑functional`	开启功能注释，默认关闭
`‑‑mito_contigs FILE`	线粒体 contig 列表文件，使用线粒体密码子（终止密码子 AGA,AGG,TAA,TAG）
`‑‑extra FILE`	外部 GFF 导入额外特征；GFF 必须包含 gene 层级；与已有注释重叠的特征会被忽略
`‑‑debug`	保留全部中间输出文件，默认关闭
`‑‑verbose`	输出详细运行日志，默认关闭
`‑‑version`	打印版本并退出
`‑‑help`	打印帮助并退出

重要：必须提供‑r或者‑e参数。

EviAnn 会保存全部中间步骤进度；程序异常中断（宕机、磁盘满），直接重复执行相同命令，会从已经完成的步骤继续运行。

输出文件前缀为输入基因组文件名。例如输入genome.fasta，输出：

genome.fasta.pseudo_label.gff：GFF3 注释文件
genome.fasta.proteins.fasta：蛋白氨基酸序列
genome.fasta.transcripts.fasta：转录本序列

输出结果解读

输出 GFF3、蛋白 fasta、转录本 fasta。按照 GFF3 规范，终止密码子包含在 CDS 区间内。

蛋白编码 mRNA 属性字段

ID：EviAnn 分配的转录本 ID
Parent：父级 gene ID
EvidenceProteinID：CDS 注释依据的蛋白 ID；附带蛋白功能描述；以XLOC开头代表仅依靠转录本比对得到，参考EvidenceTranscriptID
EvidenceTranscriptID：注释依据的转录本 ID；组装转录本存放于<PREFIX>.gtf；证据类型为protein_only时该字段为源蛋白 ID；complete/transcript_only格式：<转录本ID>:<支持该转录本的RNA‑seq实验数>:<最大TPM>
StartCodon：CDS 起始密码子
StopCodon：CDS 终止密码子
Class：蛋白比对匹配等级；可信度最高为=、k
Evidence：注释证据类型
- complete：转录本证据 + 蛋白证据同时使用
- protein_only：仅蛋白证据
- transcript_only：仅转录本证据；CDS 由 TransDecoder 预测，再经 Uniprot 比对校验
pseudo=true（可选）：标记加工假基因，该转录本不会输出 CDS

lncRNA ncRNA 属性字段

ID：转录本 ID
Parent：父级 gene ID
EvidenceTranscriptID：注释依据转录本 ID；组装转录本存放于<PREFIX>.gtf

示例 GFF 片段（蛋白编码基因、假基因、lncRNA）

NC_004353.4 EviAnn gene 29462 43759 . - . ID=XLOC_000048;geneID=XLOC_000048;type=protein_coding;Note=Similar to PLXNA2: Plexin‑A2 (Homo sapiens); NC_004353.4 EviAnn mRNA 32745 43754 . - . ID=XLOC_000048‑mRNA‑1;Parent=XLOC_000048;EvidenceProteinID=XP_001352289.2;EvidenceTranscriptID=MSTRG_00000148:4:7.702416;StartCodon=atg;StopCodon=TGA;Class==;Evidence=complete;Note=Similar to PLXNA2: Plexin‑A2 (Homo sapiens); NC_004353.4 EviAnn exon 32745 33125 . - . Parent=XLOC_000048‑mRNA‑1 NC_004353.4 EviAnn exon 33191 33373 . - . Parent=XLOC_000048‑mRNA‑1 NC_004353.4 EviAnn exon 35874 36457 . - . Parent=XLOC_000048‑mRNA‑1 NC_004353.4 EviAnn exon 36516 41285 . - . Parent=XLOC_000048‑mRNA‑1 NC_004353.4 EviAnn exon 42914 43754 . - . Parent=XLOC_000048‑mRNA‑1 NC_004353.4 EviAnn CDS 33018 33125 . - 0 Parent=XLOC_000048‑mRNA‑1 NC_004353.4 EviAnn CDS 33191 33373 . - 0 Parent=XLOC_000048‑mRNA‑1 NC_004353.4 EviAnn CDS 35874 36457 . - 2 Parent=XLOC_000048‑mRNA‑1 NC_004353.4 EviAnn CDS 36516 41285 . - 2 Parent=XLOC_000048‑mRNA‑1 NC_004353.4 EviAnn CDS 42914 43424 . - 0 Parent=XLOC_000048‑mRNA‑1 NC_004354.4 EviAnn gene 23461776 23464767 . - . ID=XLOC_001890;geneID=XLOC_001890;type=protein_coding;pseudo=true;Note=function unknown; NC_004354.4 EviAnn mRNA 23461776 23464767 . - . ID=XLOC_001890‑mRNA‑1;Parent=XLOC_001890;EvidenceProteinID=XP_046868993.1;EvidenceTranscriptID=MSTRG_00006719:2:3.697180;StartCodon=atg;StopCodon=TAA;Class=k;Evidence=complete;pseudo=true;Note=function unknown; NC_004354.4 EviAnn exon 23461776 23464767 . - . Parent=XLOC_001890‑mRNA‑1 NC_004353.4 EviAnn gene 181423 182801 . - . ID=XLOC_000055U_lncRNA;geneID=XLOC_000055U_lncRNA;type=lncRNA;junction_score=0;Note=function unknown; NC_004353.4 EviAnn ncRNA 181423 182801 . - . ID=XLOC_000055U_lncRNA‑mRNA‑1;Parent=XLOC_000055U_lncRNA;EvidenceTranscriptID=MSTRG_00000163:5:11.129138 NC_004353.4 EviAnn exon 181423 181516 . - . Parent=XLOC_000055U_lncRNA‑mRNA‑1 NC_004353.4 EviAnn exon 181569 182801 . - . Parent=XLOC_000055U_lncRNA‑mRNA‑1

使用 table2asn 提交 EviAnn 注释到 NCBI GenBank

网页生成sbt模板文件：https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/template/submission/
下载 NCBItable2asn工具：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/table2asn/
在 EviAnn 输出目录执行：

table2asn -M n -J -c w -euk -t template.sbt -gaps‑min 10 -l paired‑ends -j "[organism=latin name][isolate=isolate]" -i assembly.fasta -f assembly.fasta.pseudo_label.gff -o output.sqn -Z -V b -locus‑tag‑prefix XXXX

假设基因组文件assembly.fasta，EviAnn 注释assembly.fasta.pseudo_label.gff；XXXX为 GenBank 分配的 4 位 locus tag 前缀。输出output.sqn、output.gbf，用于 GenBank 提交。

案例 1：RNA‑seq + 近缘物种蛋白做注释

基因组：genome.fasta；RNA‑seq 双端数据rna1_R1.fastq rna1_R2.fastq、rna2_R1.fastq rna2_R2.fastq；近缘物种蛋白全部合并为proteins_all.faa。

蛋白数据量建议：昆虫 10‑20 万条；典型植物 / 哺乳动物 50 万条以上。

cat protein1.faa protein2.faa > proteins_all.faa

生成 reads 列表文件paired.txt：

$ cat paired.txt /path/rna1_R1.fastq /path/rna1_R2.fastq /path/rna2_R1.fastq /path/rna2_R2.fastq

快速生成列表（在 reads 目录执行）：

paste <(ls $PWD/*_R1.fastq) <(ls $PWD/*_R2.fastq) > paired.txt

混合数据示例paired_mixed.txt：

$ cat paired_mixed.txt /path/rna1_R1.fastq /path/rna1_R2.fastq /path/IsoSeq_rna.fastq /path/rna1_R1.fastq /path/rna1_R2.fastq /path/rna2_R1.fa /path/rna2_R2.fa fasta /path/rna3.bam bam

v1.0.8 之前版本必须写绝对路径。24 线程运行：

/path/EviAnn-X.X.X/bin/eviann.sh -t 24 -g /path/genome.fasta -r /path/paired.txt -p /path/proteins_all.faa

案例 2：无 RNA‑seq，仅依靠近缘物种转录本与蛋白（注释 lift‑over）

已有近缘物种 gff、基因组，用gffread提取转录本、蛋白：

/eviann_path/bin/gffread -W -y species1_prot.faa -w species1_transc.fa -g species1_genome.fa species1.gff /eviann_path/bin/gffread -W -y species2_prot.faa -w species2_transc.fa -g species2_genome.fa species2.gff

合并：

cat species*_transc.fa > transcripts.fa cat species*_prot.fa > proteins.faa

必须加上‑l参数，开启 lift‑over 模式

/path/EviAnn-X.X.X/bin/eviann.sh -t 24 -g /path/genome.fasta -e $PWD/transcripts.fa -p $PWD/proteins.faa -l

引用

Zimin, A.V., Puiu, D., Pertea, M.et al.Efficient evidence-based genome annotation with EviAnn.Nat Methods23, 1521–1527 (2026). https://doi.org/10.1038/s41592-026-03156-0