兔膀胱上皮（BEC）细胞的原代培养
一、简介
膀胱为重要的排尿器官，其组织结构与尿道基本相似，分为三层，即黏膜、肌层和外膜。膀胱的黏膜层呈粉红色，由移行上皮细胞组成，布满整个膀胱的最里层，向上与输尿管黏膜层、向下与尿道黏膜层相延续。黏膜形成许多皱襞，仅膀胱三角处的黏膜平滑。膀胱充盈时，皱襞减少或消失。膀胱空虚时变移上皮很厚，约8~10层细胞，表层盖细胞大，呈矩形；膀胱充盈时上皮变薄，仅3~4层细胞，盖细胞也变扁。固有层含较多弹性纤维。肌层厚，由内纵行、中环行和外纵行三层平滑肌组成，各层肌纤维相互交错，分界不清。中层环行肌在尿道内口处增厚为括约肌。外膜除膀胱顶部为浆膜外，多为疏松结缔组织。
二、材料：
1、实验动物：6-8月龄新西兰大白兔1只（雌雄不限）
2、组织来源：膀胱
3、手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）
4、消化酶：中性蛋白酶，链霉蛋白酶E
5、培养基：DMEM/F12+10%FBS+1%P/S+5ng/mlEGF和50nmol氢化可的松；
①DMEM/F12（Gibco，Cat#: 51500056）；②EGF(Cloud-Clone，Cat#:APA560HU02）
6、包被：鼠尾胶原I（翊圣，Cat#:40125ES10)
三、实验步骤
1. 培养瓶的包被：按照2ug/cm2将鼠尾胶原I加入T25培养瓶中，以覆盖培养板底部为准，37℃培养箱内放置30min，临用前用PBS清洗2次，于超净台中晾干备用。
2. 空气栓塞法处死兔子，取完整的膀胱，去除多余的脂肪和血管。
3. 将膀胱翻转后用含2%双抗的PBS将内容物涮洗干净，重复3次。
4. 待膀胱清洗干净后，用消毒灭菌后的棉绳将膀胱口扎住，然后将整个组织转入含0.15%链霉蛋白酶E的消化液中4℃过夜消化。
5. 次日拿出轻缓颠倒翻转10~12次，继续4℃消化，静置30~60min。
6. 加入10%FBS培养基终止消化，摇晃12次，收集上清（此步骤重复3次）。
7. 将三次收集到的上清经200目筛网过筛后，1000rpm离心5min。
8. 弃上清，细胞沉淀用完全培养基重悬，均匀接种在用鼠尾胶原包被的培养板中。
9. 48h后镜下观察细胞，当大部分贴壁时，更换培养基去除悬浮的细胞，之后每3天更换新鲜的培养基。待细胞生长覆盖底部80%以上时，可进行传代或冻存。
- 实验过程图片
图1 开腹后暴露出膀胱
图2 取出膀胱
图3 去除脂肪和血管的膀胱
图4 翻转并扎袋消化中的膀胱
五、各阶段的膀胱上皮细胞照片（白光）
图5、6 原代培养第3天，有大量上皮细胞样长出，呈岛屿状向四周伸展（100X、200X）
图5 （100X）
图6 （200X）
- 兔膀胱上皮细胞荧光鉴定
备注：
云克隆提供此Protocol，同时适用于猫、犬、羊等物种。
