LEfSe实战全攻略：从输入格式到结果解读及投稿绘图

做16S、宏基因组或者菌群相关课题的人，对LEfSe这个名字应该都不陌生。几乎每一篇微生物组文章里都有它那张标志性的柱状图——左边一组长条，红色代表一个分组富集的菌，绿色代表另一个分组富集的菌，横坐标写着LDA Score。可我发现一个现象：很多人把LEfSe当成了“一键寻找差异菌”的傻瓜工具，跑完拿到图就粘贴到论文里，问起原理和参数，基本是一问三不知。这其实挺危险的，因为LEfSe的统计假设、输入格式和参数选择都会直接影响最终结果。这一篇我就从实际使用的角度，把LEfSe从输入格式到结果解读、从在线平台到本地运行、从常见报错到投稿图表调整，从头到尾捋一遍。

我需要先说清楚一个定位问题：LEfSe全称是Linear discriminant analysis Effect Size，翻译过来是线性判别分析效应大小。它和DESeq2、edgeR这类差异丰度工具有本质区别，它解决的从来不是“哪些菌在两组间显著不同”这种纯统计检验问题，而是“在这些不同的菌里，哪些菌对分组差异的贡献最大、最有可能成为标志物”。很多初学者拿到一组数据，上来就追求“跑出多少种菌”，却忽略了LEfSe本身更强调效应量排序。这篇文章适合刚接触微生物组分析、准备在两个或多个分组之间寻找生物标志物的朋友，也适合那些已经跑出过图但总感觉哪里不对劲、想搞清楚背后逻辑的人。

1. 大家为什么都要跑LEfSe——它在分析流程里的位置

1.1 它其实不是“差异检验”，而是“效应量排序”

先做一个思维实验。假设你有两组样本，A组和B组，每组10个。你在某个菌属上做差异检验，发现p值小于0.05，说明它在两组间的分布确实不一样。但问题来了：p值只能告诉你“不一样”，不能告诉你“有多不一样”。一个有生物学意义的标志物，最好既稳定又在组间差别大。LEfSe做的事，就是先筛选出那些“确实有差异”的菌，再用线性判别分析计算出一个可以横向比较的分数，代表这个菌对你分组判别的贡献大小。这个分数就是LDA Score。

这和常规的Wilcoxon检验、t检验完全不是一个层面的东西。你完全可以在SPSS里对每个菌做一遍秩和检验，手动筛选p值小于0.05的菌，但那只能得到一份“差异菌清单”。LEfSe比你多走了两步：一是做了多组间的两两比较验证，二是用LDA这种有监督的分类模型把每个特征的判别能力量化出来了。这也是为什么它的结果里会有一个明确的生物标志物排序，而不是一堆菌名堆在一起。

1.2 在标准16S分析流程中的位置

我以最常用的QIIME2流程举例。你从原始测序数据开始，经过质量控制、ASV/OTU聚类、物种注释，会得到一个特征表和一个物种分类表。很多人在这里就急着导出去跑LEfSe，其实不对。LEfSe不是让你在ASV级别硬跑的，ASV级别太细，注释往往注释不到种，结果图会非常碎且难以解释；也不是让你用全部特征硬跑的，低丰度、低发生率的特征会产生大量噪音，拉低整体判别效果。

更合理的做法是：先做物种分类水平上的汇总，通常是属水平或门水平。你可以在QIIME2里用taxa collapse命令把特征表按属水平合并，再导出成LEfSe能读的格式。在我的习惯里，门水平适合看宏观趋势，属水平适合找具体候选标志物，种水平经常因为注释覆盖率不足导致数据大量缺失，一般不做首选。

从QC到差异筛选的完整链条大致是这样：质控和去噪 → 物种注释 → 按分类水平汇总 → 过滤低丰度特征和低深度样本 → 转换成LEfSe输入格式 → 跑LEfSe → 绘图和解读。LEfSe在整个流程中承担的是末端环节，但它对上游数据的要求非常苛刻，这一步没做好，后面全是白搭。

2. 数据准备：从OTU/ASV表到LEfSe输入文件的那些隐形成本

2.1 LEfSe的输入格式：行是特征，列是样本

LEfSe最让人抓狂的地方是它的输入格式。它不像DESeq2那样接受常见的行是基因/OTU、列是样本的表达矩阵，也不是你从QIIME2导出的biom转tsv后就能直接用。LEfSe要求输入文件是一个制表符分隔的文本文件，行是特征，列是样本，第一行是样本ID，第一列是特征ID。这一点看着简单，但非常容易和很多生信工具的习惯搞混，有的工具行列是反的，一粘贴进去就会报错或者输出一片空白。

一个标准的LEfSe输入表长这样：

注意，这里面的数值是每个样本中该特征的丰度，可以是抽平后的绝对丰度，也可以是相对丰度，但不能是行有缺失、含有逗号、或者用空格分隔的格式。LEfSe对文件格式非常“洁癖”，任何异常的符号都有可能导致解析失败。

2.2 从QIIME2导出分类水平特征表

我从QIIME2里导出一个可直接用于LEfSe的属水平特征表，一般分三步。第一步，用taxa collapse按属级别合并原始特征表；第二步，用qiime tools export导出；第三步，用biom convert把BIOM格式转成TSV格式，再手工处理一下表头。

qiime taxa collapse \ --i-table table.qza \ --i-taxonomy taxonomy.qza \ --p-level 6 \ --o-collapsed-table genus.qza qiime tools export --input-path genus.qza --output-path genus_export biom convert -i genus_export/feature-table.biom \ -o genus_export/feature-table.tsv \ --to-tsv

转出来的TSV表第一行是以“# Constructed from biom file”开头，第二行是“# OTU ID”加上样本ID。你需要手工把第一行注释删掉，把“# OTU ID”改成“feature”之类的特征列名，再把第一列中类似“k__Bacteria; p__Firmicutes; ...”的完整分类路径改成简短的名字。如果你用的是Galaxy在线版的LEfSe，这些紧凑的物种名其实可以直接传，但后续画图时的标签会很长，几乎看不清，所以我还是建议先手动整理一把。

2.3 该不该做相对丰度转换

这是被问得最多的问题之一。官方文档并没有强制要求用相对丰度，但实际跑下来我强烈建议使用相对丰度或经过正规化处理的数据。原因很简单：不同样本的测序深度差异很大，直接用原始绝对读数，测序深度高的样本会在LDA中占据更大的权重，导致结果主要反映测序深度而非生物学差异。

我自己常用的方案是，先把特征表按样本抽平到同一深度，通常用最低样本深度或一个固定值如10000，然后再计算相对丰度或者直接使用抽平后的绝对丰度。抽平会让矩阵变得稀疏，低丰度特征的零值大量增加，这正好触发LEfSe里的非参数检验逻辑，影响不大。但如果你的样本深度差异悬殊，比如一个样本只有2000条序列，另一个有80000条，那我会建议考虑更正规化的方式，或者至少检查一下抽平后低深度样本会不会因为大量特征被抽成0而失去代表性。

2.4 样本量和分组文件

LEfSe里没有硬性规定每组最少几个样本，但从统计效力来说，每个分组少于5个样本时跑出来的结果基本不具备说服力，哪怕它能出图，审稿人也一定会质疑。我的经验是每组至少6到8个，最好超过10个，这样非参数检验才有足够的分布形态来判断差异。组间样本量最好也不要差太多，你拿A组50个和B组5个去比，得到的显著菌很大概率是样本量差异造成的假象。

分组信息在Galaxy版里对应的是映射文件，在本地命令行版里对应的是输入数据中特定的行。Galaxy版要求额外上传一个映射文件，包含样本ID和对应的分组列。分组列里的值最好是纯英文或拼音，避免使用中文和特殊字符，否则后续画图大概率会出现编码问题。这个坑我踩过不止一次，后面在问题排查部分会展开讲。

3. 算法原理：Kruskal-Wallis、Wilcoxon和LDA是怎么配合的

3.1 第一层：Kruskal-Wallis检验排掉无差异的特征

LEfSe算法内部其实分了三步，很多人只知道最后一步LDA，导致对结果的理解出现偏差。第一步是对所有特征做Kruskal-Wallis秩和检验，目的是在多组之间找出那些丰度分布在组间存在显著差异的特征。这个检验是非参数的，不假设数据服从正态分布，对丰度数据这种严重右偏、带大量零值的分布类型比较友好。

这里我想提醒一个很多人忽略的设定：Kruskal-Wallis检验的零假设是所有分组的分布相同。在你的分组数量大于2时，这个检验标准是“至少有一组和其他组不同”，但并不会告诉你具体是哪两组不同。所以这一步解决的是“有没有差异”的问题，而不是“哪两组之间有差异”。

3.2 第二层：Wilcoxon两两比较守住方向性

第二步是对筛选出的特征做Wilcoxon秩和检验，也就是两组间的非参数检验。当分组数量大于2时，LEfSe会在组与组之间进行两两比较，比如A组与B组比、A组与C组比、B组与C组比。这一步的目标是确认某种差异不是由某一对组别偶然产生，而是在多组背景下依然稳定。

这一步有一个容易被忽视的关键设定：对于只有两组的设计，这个Wilcoxon检验和第一步的Kruskal-Wallis在逻辑上是重叠的，并不会额外增加太多筛选力度。你可能会想，那两组数据是不是就没必要跑LEfSe了？其实不是。两组设计里，LEfSe的价值主要还是靠最后的LDA效应量排序来体现，前面两步只是做了一遍基础筛选。

3.3 第三层：LDA给出可排序的效应量

经过前两步筛选后，剩下的特征就是“有差异且方向稳定”的候选集。第三步才是LEfSe的核心：用线性判别分析构建一个分类模型，用所有候选特征的组合来预测样本所属的分组，然后计算每个特征在这个判别模型中的权重系数。

LDA的基本思想是寻找一个线性组合，使得组间差异尽可能大、组内差异尽可能小。每个特征在这个组合里的载荷系数经过归一化后，就变成了LDA Score。这个分数的绝对值越大，代表该特征对区分不同分组越重要。这个分数是可以跨特征排序的，这也是LEfSe结果里所有菌按分数从高到低排列的原因。原始分数通常非常大，所以LEfSe默认给的是以10为底的对数转换后的值，你在图中看到的LDA Score 3.2，实际上是原始判别权重经过对数压缩的结果。

3.4 为什么LDA阈值一般取2.0

LEfSe有一个核心参数叫LDA Score threshold，默认值通常是2.0。这个值的含义是：只有经过对数转换后LDA分数大于等于2.0的特征才会被保留并出图。换算成原始分数，就是100倍以上的判别权重，也就是说，这个特征本身就能非常强地把样本区隔到不同分组里。

经常有人问：我把阈值设成1.5行不行？设成3.0行不行？技术上都可以，但你要理解背后的代价。阈值越低，保留的特征越多，假阳性也越多；阈值越高，保留的特征越少，但留下来的通常是极强效应量的标志物。在探索性分析阶段，我一般先用默认的2.0，然后在验证阶段把阈值提高到3.0甚至4.0，看看核心标志物是否依然稳定。稳定的才是值得继续投入实验验证的候选，只靠阈值降低才出现的一堆菌名，大概率是噪音。

4. 实操：两种运行方式和参数怎么选

4.1 在线Galaxy版：适合快速出结果

对于只跑一两次、不想折腾环境的用户，Galaxy在线平台是最快的方式。你可以在公共Galaxy服务器里搜索LEfSe，上传特征表和映射文件，选择分组列，点击运行即可。好处是零安装，界面友好，坏处是公共服务器有时候排队比较久，而且上传数据的隐私性需要你自己评估。如果你做的是临床样本、涉及未发表数据或受控数据，我还是建议用本地方式。

Galaxy界面上有几个必填项：第一个是特征表，第二个是映射文件，第三个是选择分组列。分组列是指映射文件中哪一列用来定义你的分组，比如“Group”这一列里的值就是Healthy和Disease。可选参数还包括子类列、LDA Score阈值、Wilcoxon检验的p值阈值等。默认参数能跑通大部分场景，但要根据自己数据调整采样设计和多重比较策略。

4.2 本地conda版：适合批量处理和可复现

本地运行最大的优势是可复现性和批量处理。你整理好代码脚本之后，以后换一批数据、换个阈值，改一行命令就能重新跑完，这在写论文补充材料、应对审稿人要求时会方便很多。LEfSe已经发布在bioconda仓库里，安装很简单：

conda create -n lefse -c bioconda lefse -y conda activate lefse

安装好之后，整个流程通常分四步：格式化输入 → 运行LEfSe → 画LDA柱状图 → 画cladogram进化分支图。

format_input.py feature_table.tsv lefse_input.txt -c 1 -s 2 -o 1000000 run_lefse.py lefse_input.txt lefse_output.txt -l 2.0 plot_res.py lefse_output.txt lda_bar.pdf plot_cladogram.py lefse_output.txt cladogram.pdf

这里唯一需要解释的是format_input.py这一步。它的作用是把你的特征表加上分组信息，转换成LEfSe内部使用的格式。这里的“-c 1”和“-s 2”不是指第1列和第2列，而是指类别信息和子类信息位于输入文件的第1行和第2行（行号一般是0基或1基取决于版本，不同版本之间有些差异）。你需要事先在特征表最前面插入一行分组信息，每列对应一个样本的分组值；如果要控制配对信息，再加一行子分类。

4.3 关键参数怎么填

几个我每次都要注意的参数，整理成一张表：

大多数情况我建议使用全默认。唯一的例外是你发现结果里候选菌过多或过少时，优先调整LDA阈值，而不是去动p值阈值。先看表格里检验显著的菌有多少，再决定LDA阈值应该调高还是调低。

5. 结果解读：柱状图、cladogram和表格，先看哪个后看哪个

5.1 先读LDA柱状图还是cladogram

跑完LEfSe一般会得到几个输出：一个结果表、一张LDA柱状图、一张cladogram，在Galaxy里还能选输出每个显著特征的丰度差异箱线图。很多人下载完图以后，直接先看最醒目的柱状图，这其实不是最高效的方式。柱状图是按照LDA分数从高到低排列的，它告诉你“哪些菌重要”，但不会直观告诉你这些菌在分类学上属于什么位置，也看不出不同组间的结构差异。

我个人的习惯是：先看LDA柱状图，快速建立一个数量概念。看有多少正方向、多少负方向的菌，正方向代表在其中一个组富集，负方向代表在另一个组富集。接着马上看cladogram，把具体菌放到分类树里看全局。最后去翻结果表，核对p值和LDA分数，这才是论文里真正可以引用和写进方法学部分的依据。

5.2 cladogram读图的三个要点

cladogram那张圆环图看起来很复杂，密密麻麻全是节点和颜色，初次接触的人一眼望过去基本是懵的。我总结出三个阅读要点，掌握以后这张图其实很有信息量。

第一，看颜色分布。图例边上通常会标出A组和B组，图中每个节点或圆点如果被标成A组的颜色，就代表这个分类群在A组显著富集，B组同理。颜色相同的区域连成一片，说明这一支在分类学上同属一个大类群在某个分组里占优势。

第二，看节点大小。节点的大小通常代表该分类群在样本中的平均丰度，节点越大，整体丰度越高。如果一个节点又大又带颜色，那基本就是你要找的核心标志物，它既有较高丰度，又有显著的分组差异。

第三，看层级。最内圈是域，往外依次是门、纲、目、科、属，最外圈是种。当你看到某一圈的某个节点有颜色，往上推它所属的门有没有颜色也很重要，这能帮你判断这种差异是整支大类群共同变化的系统差异，还是某一具体小分支的局部差异。这两种情况的生物学解读完全不同，写论文时要格外注意。

5.3 输出表格才是写论文时真正要引用的东西

柱状图和cladogram适合人眼浏览和入文排版，但真正支撑结论的是那个结果表。表格里每一行代表一个显著特征，包含了特征名、分组方向、LDA分数、Kruskal-Wallis的p值、Wilcoxon的p值。写论文时，你需要从这张表里筛选出最核心的几个特征，而不是把几十个显著的菌全部列在正文里。一般3到8个核心标志物就足够讲一个完整的故事了，选的太多反而显得没有重点。

我见过不少同学在LDA柱状图里看到20几个显著菌，兴奋得全写进摘要，结果被审稿人要求解释每个菌的生物学功能，直接卡壳。记住，标志物筛选只是起点，论文的重点是把筛选出的标志物和你的研究问题建立逻辑关联。

6. 翻车现场：格式、零值、样本量引发的常见问题

6.1 特征名和样本名的“脏”问题

LEfSe对输入文件里符号的容忍度很低，这是我踩过最多次的坑。特征名列里如果包含括号、引号、井号、百分号这类字符，跑个流程下来要么直接报错，要么输出文件里出现乱码或异常标签。尤其是菌名注释结果里常见的“k__Bacteria;p__Firmicutes”“[Eubacterium]”这类带方括号的内容，一定要提前替换掉。我的建议是，在整理特征表的时候，把物种名里的“k__”“p__”“__”这些前缀全部去掉，只保留最后的属名或种名，并且把空格换成下划线。

样本ID也需要注意。样本名里不要用减号开头、不要有空格，不要以数字开头，尽量用字母加数字的组合。另外，分组列中的值要严格一致，Healthy就是Healthy，不要出现“Healthy ”带一个空格或者“healthy”大小写不一样的情况，这在映射文件里是极其隐蔽的错误。

6.2 一个分组只有几个样本时

前面我提到每组样本量最好大于5，这不是强迫症，而是LEfSe的非参数检验在极小样本量下确实容易失效。你可能遇到过这种情况：跑了半天，结果表里一行结果都没有，控制台输出一个“No features are significant”的提示。很多人的第一反应是调整参数，降低LDA阈值，但往往没用，因为问题出在第一步Kruskal-Wallis检验根本没筛出任何显著特征。

这是因为样本量太少，秩和检验的p值无法小于你设定的0.05阈值。遇到这种情况，我的看法是：不要强行调低阈值去“抢救”结果。阈值调低产生的“显著”基本是统计假象。你应该回到实验设计，看看是样本量确实太少，还是分组划分不够合理。如果样本量已经无法补充，可以考虑换用更适合小样本的方法，或者把多个分组合并成两组来增加每组样本量。

6.3 零值过多导致结果“全空白”

另一个常见翻车场景是特征表过于稀疏，大量样本里某种菌的丰度是0。零值太多，非参数检验会失去敏感度，因为大量的特征在所有样本里都是0或接近0，秩和根本排不出差异。对于这种情况，我建议在跑LEfSe之前先做一次特征过滤：删除在超过80%样本里都为0的特征，或者删除最大相对丰度小于0.01%的特征。这个过滤步骤不是LEfSe自带的，需要你自己在数据处理阶段完成。

我以前处理过一个肠道菌群数据集，原始ASV级别特征有上万个，直接跑LEfSe，结果几乎全空白。后来我把特征先按属水平合并，再过滤掉低丰度和低出现率的属，最终才得到一张能看的图。零值问题不只是影响LEfSe，在任何微生物差异分析里都需要提前处理，只是LEfSe对这个问题格外敏感。

6.4 subclass用不对，配对实验白白浪费

如果你的实验设计是配对样本，比如同一批患者治疗前和治疗后，或者同一块田的两个处理，那么LEfSe里有一个参数叫subclass，你一定要用上。subclass的功能是把样本分成更小的子组，让非参数检验能够识别出“配对”结构，避免因为个体间的基线差异掩盖真实的处理效应。

我用一个实际场景说明：你有10个病人，每人采集了治疗前和治疗后两个时间点的样本，这时候如果只给每个样本打上“治疗前”“治疗后”的标签，忽略每对样本来自同一个病人的事实，LEfSe的检验会认为所有样本彼此独立，个体差异可能占用很大的方差，导致治疗效应检不出来。如果有Subclass行，把病人ID放进去，LEfSe就会在每个病人的框架内比较治疗前后差异，统计效力会好很多。这个功能在Galaxy里对应subclass列，在本地format_input.py里通过-s参数指定。很多人在设计配对实验时忽略了这一点，非常可惜。

6.5 结果过拟合和生物学解释过界

最后这个“坑”不是报错，而是逻辑问题。LEfSe的LDA部分本质上是有监督分类，它找出的特征组合是对当前数据集最优的判别组合，因此天然存在过拟合的倾向。也就是说，你跑出来的这些标志物，可能在你当前这批样本里区分度很高，换一批独立样本就未必还能区分。

写论文时，LEfSe结果的定位应该是“探索性发现”，它提示你哪些菌值得进一步关注，但不等于这些菌就是因果性的生物标志物。如果你有条件，强烈建议在另一个独立队列里验证这些标志物是否仍然保持相似的富集模式；如果没有独立队列，也要在讨论部分诚实说明这一局限性。这不仅是学术诚信问题，也是避免被审稿人挑出逻辑漏洞的关键。

7. 投稿前我做过的那些小调整

7.1 配色和labels

LEfSe默认输出图的配色和标签排版说实话和期刊审稿人的审美经常会有冲突。默认的绘图脚本会把所有显著特征名挤在柱状图左侧，特征一多，字体重叠，根本看不清。在入文之前，我通常会先用plot_res.py控制输出的标签数量，比如只显示LDA分数排名前20的特征，然后在矢量图编辑软件里调整字体大小和颜色。

如果你用的是本地命令行，绘图脚本本身就带一些参数可以控制图片效果。比如用--max_labels限制标签数量，用--dpi控制分辨率，用--format pdf输出矢量格式。颜色方面，LEfSe默认的红色和绿色在色盲友好性上表现一般，我投稿前一般会改成蓝橙或者黄紫配色。

7.2 控制展示的数量

一张图里塞太多特征，看似内容丰富，实则阅读体验极差，也会让审稿人觉得结论太散。我自己的习惯是：正文里的LEfSe图只放LDA分数排名前10到20的特征，其余的特征可以作为补充材料放在附加文件里。筛选依据不是只看LDA分数高低，要看这个特征是否和你关注的生物学问题相关。比如你在研究肥胖和肠道菌群，结果里出现一个LDA分数很高但和你研究背景毫无关联的菌，你就要谨慎，最好去查一下这个菌的文献背景，看能不能给出合理解释。如果完全讲不清楚，宁可不把它作为核心结论展示。

7.3 整理到最终图形的注意

调整最终图形时，我一般会在Adobe Illustrator或者Inkscape里做最后的排版。主要做的事有三件：一是把分类名改成斜体，这是微生物命名规范；二是把柱状图的坐标轴标题写清楚，比如“LDA Score (log10)”；三是给不同分组加一个小的图例说明。很多期刊要求图片中的字体统一，默认的Helvetica或者Arial通常比较安全。cladogram那张图我一般不主动改内部节点结构，只调整外圈分类标签的字体大小，避免重叠。

另外对所有入文图片，我强烈建议导出成PDF或者SVG矢量格式，不要用截屏的PNG。审稿人放大查看时，矢量图不会糊，修改文字颜色也方便。PNG适合发微信给合作者快速预览，不适合正式投稿。

最后再分享一个我自己用了很久的小习惯。在提交修回稿之前，我会把所有参数写进方法学部分，注明LDA阈值、p值阈值、使用的软件版本和输入数据的类型。很多期刊现在对生信分析的可复现性要求越来越高，你写清楚参数组合，既是对读者负责，也是对自己工作的尊重。LEfSe跑起来很简单，难的是让每个参数选择都经得起追问，让每一张图都真正服务于你的生物学结论。