KEGG网络图从入门到发表：三种实操路径与避坑指南

拿到富集分析结果之后，很多人第一反应是截一张气泡图或者柱状图放进文章里。但气泡图只能告诉你哪些通路显著富集了，回答不了另一个问题：这些通路之间是什么关系？哪些基因同时参与了多条通路？哪条通路是整个调控网络里的枢纽？

我第一次被问到这个问题，是在某个多组学项目里。当时客户拿着几十条显著富集的KEGG通路列表，问我能不能画一张更“高级”的图，让审稿人一眼看出通路之间的共享关系和核心节点。那时候我意识到，纯气泡图在解释复杂生物学故事时确实不够用，而KEGG网络图恰好能补上这个缺口。

这篇文章我会把KEGG网络图的整个制作流程拆开来讲。从概念辨析、数据准备，到三种主流做法（官网工具、R本地绘图、Cytoscape深度定制），再到我实际操作中踩过的坑和排查经验。不需要你有很强的编程基础，跟着步骤走，基本能复现出可用于发表的结果。

1. 先搞清楚你要做哪一种“KEGG网络图”

我以前在答疑群里见过不少同学把“KEGG网络图”理解成同一种东西，结果做出来的图和预期完全不一样。实际上，日常交流里被统称为“KEGG网络图”的至少有三种变体，功能和应用场景差别很大。

1.1 三种常见类型的应用场景对比

其中使用频率最高、也最容易被卡住的是第二种和第三种。如果你只是想说明“这些通路共享了哪些基因”，基因-通路二分网络图是首选。如果你想突出“通路之间存在协同调控关系”，那通路-通路共享网络图更适合。而KEGG Mapper自带的Brite层级图，更多是用于补充材料里的结构性展示，不太承担核心可视化任务。

1.2 为什么网络图比气泡图更有说服力

气泡图本质上是一个点阵图，横轴是富集分数或基因比例，纵轴是通路名称，点的大小和颜色映射基因数和显著性。它非常直观，但维度有限，无法表达基因在通路间的重叠关系。而网络图天然适合表达“关系”——节点代表基因或通路，边代表共享、参与或共调控关系。

举一个真实场景：如果你在肿瘤数据里筛出一个代谢重编程相关基因，它同时出现在糖酵解、磷酸戊糖途径和氨基酸生物合成三条通路里。气泡图上你要放三张图才能说清楚，网络图里一次就展现出来，而且还能把这个基因高亮成核心枢纽节点。审稿人不需要来回比对列表，图本身就说明了问题。

所以我的建议是：不要把网络图当作气泡图的替代品，而是当作补充。气泡图展示“哪些通路显著”，网络图回答“这些通路怎么联系起来”。两套图配合使用，故事会更完整。

2. 做图之前的数据准备：这一步决定成败

很多人的问题不在于不会画图，而在于输入数据本身就是错的。KEGG网络图的数据准备涉及基因ID格式、物种对应关系和富集结果的格式规范，任何一个环节出问题，后边全白做。

2.1 基因ID转换：你手里的基因名可能压根没法用

KEGG的富集分析接口（无论是官网还是R包）默认使用的是KEGG官方基因ID，或者NCBI的Entrez Gene ID。但我们手头拿到的高通量测序结果，通常是基因Symbol（比如TP53、EGFR这类可读性强的名字）。直接把Symbol丢进去跑KEGG富集，大概率会报错或者匹配率极低。

这里就需要做ID转换。R语言里最常用的是clusterProfiler包自带的bitr()函数，底层依赖org.Hs.eg.db这类物种注释包。转换格式很简单：

library(clusterProfiler) library(org.Hs.eg.db) gene_symbol <- c("TP53", "EGFR", "MYC", "CDK1") entrez_ids <- bitr(gene_symbol, fromType = "SYMBOL", toType = "ENTREZID", OrgDb = org.Hs.eg.db)

我遇到过不少人倒在这一步，原因通常有两个。一是物种注释包没装对，人的数据用的是org.Hs.eg.db，小鼠是org.Mm.eg.db，这些对应关系必须匹配。二是Symbol名字的大小写问题，人的基因Symbol是全大写，而小鼠是首字母大写其余小写，用错格式会导致大批基因匹配不上。

2.2 背景基因列表的坑：为什么你富集出来的通路总是那么“大路货”

KEGG富集分析的计算逻辑是超几何分布检验，需要两个基因集合：一个是你的目标基因列表（比如差异表达基因），另一个是背景基因列表（通常是被测序到的所有基因，或者整个基因组注释基因）。如果背景基因列表不设置或设置不当，富集结果会极其偏颇。

举个极端例子：如果你的差异基因列表里恰好有20个基因都落在“代谢通路”这个大条目下，而背景基因列表是全基因组，这个通路的富集显著性会非常高。但问题是KEGG的“代谢通路”是很多子通路的上层集合，基因覆盖面广、显著性天然占优势。这也是为什么很多人跑出来的KEGG富集top通路总是那么几个“大而全”的条目，看起来合理，实际信息量很低。

我个人的做法是：背景基因列表优先使用该样本所属平台实际检测到的基因集。比如芯片数据就用芯片覆盖的基因，转录组就用表达矩阵里所有基因（过滤掉没检测到的）。这个列表越大，富集结果越保守，但可信度也越高。设置方法很简单，clusterProfiler的enrichKEGG()函数里有个universe参数，传进去即可。

2.3 富集结果文件的格式规范

无论用在线工具还是R包，最后你都会拿到一份富集结果表，通常包含这些列：通路ID（如hsa00010）、通路描述（Glycolysis / Gluconeogenesis）、基因列表（以/分隔的基因ID）、富集分数、p值、校正后的p值（padj或q值）。

做网络图需要的核心信息其实只有三样：通路ID、通路描述、基因列表。其他的列（p值、富集分数）可以在网络图里映射成节点的颜色或大小，所以尽量保留。如果是用在线工具（比如KEGG官网的KEGG Mapper或DAVID）导出的结果，注意看一下表格分隔符是制表符还是逗号，Excel直接打开可能会把ID和描述拆乱，我建议先用文本编辑器检查一下再导入R或Cytoscape。

提示：使用表格数据前，务必在Excel之外再确认一列数据的完整性。尤其是基因列表列，如果某条通路对应的基因列表太长被Excel截断了，后边做共享网络时边会缺一大半。

3. 实操路径一：KEGG Mapper官网快速出图

如果你只是想在补充材料里放一张“基因在通路上的分布图”，或者需要快速确认目标基因参与了哪些通路，KEGG Mapper是最快的路径。不需要任何编程能力，全网页操作。

3.1 操作步骤拆解

打开KEGG Mapper的页面（在KEGG数据库主站内），选择“KEGG Mapping”下的Search/Color Pathway功能。你需要准备的是一个基因ID列表文件，每一行一个基因，ID可以是KEGG官方ID或Entrez ID。物种代码必须提前确认：人的代码是hsa，小鼠是mmu，大鼠是rno，斑马鱼是dre，拟南芥是ath。这个代码错了，匹配率会惨不忍睹。

具体流程：

1. 在页面里选择目标物种代码。
2. 粘贴基因列表或上传txt文件。
3. 选择映射类型，这里可以只映射目标基因（Reagent），也可以映射到所有通路。
4. 提交后选择想要展示的通路数据库，默认覆盖全部通路分类。
5. 在结果页面里会列出所有命中的通路，点击任意一条，KEGG会打开标准的通路图，并把你的基因在通路节点上高亮显示（默认红色）。

如果你想调整高亮颜色，比如把上调基因标成红色、下调基因标成绿色，KEGG Mapper支持通过提交带颜色代码的映射表来实现。格式是：两列制表符分隔，第一列基因ID，第二列颜色代码（如#ff0000）。这个功能在展示表达变化方向上非常实用，比单纯标记“有没有”信息量更大。

3.2 官网工具的几个天然局限

KEGG Mapper出的图本质上还是在KEGG标准通路图上着色，优点是与数据库注释完全同步、不用自己维护布局，但局限也很明显。第一，它只有单条通路的视图，不能展示“通路与通路之间”的网络关系。第二，每条通路的节点布局是KEGG官方固定的，基因多的通路图会非常拥挤，一旦高亮基因多，图面就成了一团红点。第三，图片分辨率有限，而且不能自由修改样式，如果期刊对图片细节有较高要求，这个图往往需要二次处理。

所以我一般把KEGG Mapper当作“验算工具”而不是“最终出图工具”。在做正式网络图之前，先用官网图验证一下基因与通路的映射是否合理；在得到正式网络图之后，也可以用官网图作为补充材料里的单通路证据。两者配合，逻辑上更完整。

4. 实操路径二：R本地实现基因-通路网络图

接下来是重头戏，用R从富集分析开始，一直画到可发表级别的基因-通路网络图。这套流程的优势是数据可控、可复现，而且所有中间文件都能保存下来供后续调整。

4.1 完整R代码流程

我这里以一个常见的转录组差异基因分析场景为例。假设你已经拿到了差异基因的Symbol列表，目标物种是人。

# 1. 加载必要R包 library(clusterProfiler) library(org.Hs.eg.db) library(igraph) library(ggraph) library(tidyverse) # 2. ID转换：Symbol -> Entrez ID deg_symbol <- c("TP53", "EGFR", "MYC", "CDK1", "HIF1A", "VEGFA", "LDHA", "PKM", "HK2", "SLC2A1", "PDK1", "MTOR") entrez <- bitr(deg_symbol, fromType = "SYMBOL", toType = "ENTREZID", OrgDb = org.Hs.eg.db) # 3. KEGG富集分析 kegg_rich <- enrichKEGG(gene = entrez$ENTREZID, organism = "hsa", keyType = "kegg", pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.2, use_internal_data = FALSE) # 转成数据框方便操作 kegg_df <- as.data.frame(kegg_rich) # 4. 提取基因-通路关系对 edges <- kegg_df %>% dplyr::select(ID, Description, geneID) %>% separate_rows(geneID, sep = "/") %>% dplyr::rename(pathway_id = ID, pathway_name = Description, gene_id = geneID) # 5. 构建节点表：通路节点 + 基因节点 pathway_nodes <- edges %>% dplyr::select(node = pathway_id, name = pathway_name) %>% dplyr::distinct() gene_nodes <- edges %>% dplyr::select(node = gene_id, name = gene_id) %>% dplyr::distinct() nodes <- bind_rows( pathway_nodes %>% dplyr::mutate(type = "pathway"), gene_nodes %>% dplyr::mutate(type = "gene") ) # 6. 构建网络对象 net <- graph_from_data_frame( d = edges[, c("pathway_id", "gene_id")], directed = FALSE, vertices = nodes ) # 7. 计算节点度并映射到节点大小 V(net)$degree <- degree(net) # 标记通路节点 node_type <- V(net)$type # 用ggraph绘制 p <- ggraph(net, layout = "fr") + geom_edge_link(aes(colour = ..index..), alpha = 0.3) + geom_node_point(aes(size = degree, color = type)) + scale_color_manual(values = c(pathway = "#E64B35", gene = "#4DBBD5")) + theme_void() + theme(legend.position = "bottom") ggsave("kegg_gene_pathway_network.pdf", p, width = 12, height = 10)

4.2 为什么用Fruchterman-Reingold布局，以及参数怎么调

代码里我使用了layout = "fr"，即Fruchterman-Reingold力导向布局。它的原理是模拟物理系统中的弹簧模型：相互连接的节点互相吸引，不连接的节点互相排斥，经过若干轮迭代后达到稳定状态。在生物学网络中，这个布局能自动把共享基因多的通路拉近，把关联少的节点推远，结构一目了然。

如果你的网络边数太多，FR布局容易变成一团毛线球。这时候有几个参数可以调：迭代次数（niter）调大一些让布局更稳定；weights参数按共享基因数加权，核心关联会更突出；节点标签如果重叠严重，可以只在度大于某个阈值的节点上显示标签。

还有一个小经验：通路节点和基因节点如果都按度映射大小，通路节点通常会非常大，因为一条通路可能连着几十个基因。为了让视觉平衡，我会把基因和通路分成两组独立映射，然后分别调整缩放系数。

4.3 通路-通路共享网络图的快速实现

如果你想看的是通路之间的关系，不需要所有基因节点都上图中，而是把通路当作唯一节点，用共享基因数作为边的权重。核心代码更简洁：

# 基于edges计算通路对共享基因数 pathway_pairs <- edges %>% dplyr::select(pathway_id, gene_id) %>% dplyr::inner_join(edges %>% dplyr::select(pathway_id, gene_id), by = "gene_id", suffix = c("_a", "_b")) %>% dplyr::filter(pathway_id_a != pathway_id_b) %>% dplyr::count(pathway_id_a, pathway_id_b, name = "shared_genes") # 过滤掉共享基因太少的关系对，降低网络密度 pathway_pairs <- pathway_pairs %>% dplyr::filter(shared_genes >= 2) # 建立通路节点表 pathway_nodes <- kegg_df %>% dplyr::select(node = ID, name = Description) %>% dplyr::distinct() # 建立网络 net2 <- graph_from_data_frame( d = pathway_pairs[, c("pathway_id_a", "pathway_id_b")], directed = FALSE, vertices = pathway_nodes ) E(net2)$weight <- pathway_pairs$shared_genes # 绘图，边宽度映射共享基因数 p2 <- ggraph(net2, layout = "fr") + geom_edge_link(aes(width = weight), alpha = 0.4, colour = "grey50") + geom_node_point(aes(size = degree), colour = "#E64B35") + scale_edge_width(range = c(0.5, 4)) + geom_node_text(aes(label = name), repel = TRUE, size = 3) + theme_void() ggsave("kegg_pathway_network.pdf", p2, width = 11, height = 9)

这里有个关键判断：共享基因数阈值是设成2还是3，取决于你的富集结果里基因列表的长度。如果每条通路都连了几十个基因，共享1个基因的关系对会非常多，整个网络会非常密集、失去可读性。我一般先画一版阈值设为1的图看看规模，如果边数超过80条就上调阈值。

5. 实操路径三：Cytoscape深度定制网络图

R里的ggraph适合快速出图，但如果你需要精细调整布局、叠加多种属性映射，或者做多组学数据的整合可视化，Cytoscape是绕不开的工具。它在网络可视化这个领域做了十几年，生态非常成熟。

5.1 从R导出Cytoscape能识别的格式

Cytoscape对网络文件格式的要求很宽松，但它最常用、最稳定的是SIF（Simple Interaction Format）和GML。我习惯导出SIF加一个属性表，分两步走：

# 导出SIF格式网络文件（三列：节点1 关系 节点2） edges$relation <- "interacts_with" # 关系类型占位 write.table(edges[, c("gene_id", "relation", "pathway_id")], "network.sif", sep = "\t", row.names = FALSE, col.names = FALSE, quote = FALSE) # 导出节点属性表（节点ID、类型、度、富集p值等） node_attr <- data.frame( node = V(net)$name, type = V(net)$type, degree = V(net)$degree ) write.table(node_attr, "node_attributes.txt", sep = "\t", row.names = FALSE, quote = FALSE)

SIF文件本质上就是一个三列的制表符分隔文本文件，第一列是起点，第二列是关系类型，第三列是终点。Cytoscape导入SIF后会自动把“interacts_with”识别为边的属性。节点属性表则用Cytoscape的Import Table功能挂载上去。

5.2 Cytoscape界面操作要点

导入SIF后，Cytoscape会自动生成一个无布局的网络，你需要手动选择Layout工具。我个人比较常用的是Prefuse Force Directed Layout，它在处理中等规模网络（几百个节点）时比内置的Grid Layout效果好很多。布局的力度参数可以适当调节，让节点之间重叠少一些。

然后是视觉映射。在Style面板里，把节点大小映射到degree属性（连续映射），颜色映射到type属性（离散映射，我给通路设为暖色、基因设为冷色）。边的透明度如果过高，会把整个图的层次感吃掉；我一般设在0.3到0.5之间。节点标签默认全开会显示，非常拥挤，建议在Label Mapping里设置一个映射规则：只有degree大于等于某个阈值的节点才显示标签。

Cytoscape还有几个值得去翻的增强功能：NetworkAnalyzer插件可以算出介数中心性、接近中心性等网络拓扑参数，直接映射到节点大小或颜色上，用来识别“枢纽通路”非常有说服力；如果通路之间共享基因的权重信息已经导入了，还可以用边的宽度映射权重，这样共享基因越多的通路对，连线越粗，视觉层级一目了然。

5.3 多组学数据怎么在一张图里体现

如果你的数据是转录组+蛋白组，或者加了代谢组，Cytoscape的优势就出来了。你可以在节点属性表里增加几列，比如转录组表达变化倍数、蛋白组表达变化倍数、代谢物丰度等，然后把节点颜色映射成渐变。比如转录组上调用红色系、下调用蓝色系，蛋白组变化通过节点边框颜色映射。

但这里要特别提醒一句：多组学整合的网络图最容易犯的毛病是“为了复杂而复杂”。如果每个基因节点都要映射两层以上属性，图面会失去重点。我个人的经验是，一张图只讲一个故事。要么这张图重点展示“哪些基因在关键通路间充当桥梁”，要么重点展示“通路的模块化结构”，不要把表达方向、显著性、共享基因数全都堆在同一张图里。

6. 常见问题与排查技巧实录

做KEGG网络图的过程中，我遇到的绝大多数问题都集中在这几个类别里，这里整理成一张速查表，方便你对照排查。

6.1 高发问题速查表

6.2 几个影响出图质量的关键细节

关于富集p值的筛选。很多人把pvalueCutoff设成0.05后就什么都不管了。实际上qvalueCutoff（校正后p值）才是更该关注的。转录组数据动辄上万个基因做检验，多次假设检验会大幅提高假阳性率，建议至少看q值。如果你的通路数量太少（小于5条），画网络图意义不大，我建议回到差异基因筛选步骤，适当放宽差异倍数阈值，扩大输入基因列表的规模。

关于阈值选择的逻辑。通路之间共享基因数的阈值到底设多少，可以通过一个简单的统计来判断：先算出所有通路对的共享基因数分布，看中位数和众数。如果大部分通路对只共享1个基因，说明关系非常稀疏，阈值设为1；如果共享2个基因的关系对超过30条，阈值就设到2或3。这个判断比拍脑袋设阈值要靠谱得多。

关于图片导出格式。如果是为了发表，PDF或SVG这种矢量格式是必需品，矢量图在编辑和缩放时不会失真。R里的ggsave()支持通过device = "pdf"或device = "svg"输出矢量图。如果你担心图片里的字体在投稿系统里显示异常，记得把字体全部转换成曲线路径再导出，很多期刊对嵌入式字体会做严格检查。Cytoscape导出图片时会让你选导出类型，PDF格式里有一个“Export as PDF”选项，需要注意文字转曲的设置在Cytoscape里默认是可以勾选的。

关于网络图的可读性上限。一个网络中节点数在30到80之间是视觉体验最好的区间。如果节点数超过100，我已经很难保证读者能看明白结构了。这时候我会先筛选核心通路。选哪些通路作为网络图的子集？一个比较可靠的方法是：优先保留与你的研究假设直接相关的通路，再按度或介数中心性补充关联枢纽通路。没必要把富集列表里所有通路都塞进网络图里。

6.3 为什么你的网络图“看起来不专业”

这个问题我收到过太多次了，大多数时候不是技术问题，而是审美和叙事的问题。专业技术上的表现，常常是几个加起来的：

1. 配色系统混乱。热色冷色混着用，饱和度差别不大，节点之间缺乏对比度。
2. 点大小映射没有设置合理的缩放范围，所有点几乎一样大，度这个信息没有传达出来。
3. 节点标签字体太小或太大，与图的整体比例不协调。
4. 边没有透明度分层，主次关系完全看不出来。

我的固定组合是：通路节点用高饱和度的有彩色（比如红、橙），基因节点用低饱和度的冷色（比如浅蓝、灰蓝），边的颜色统一用灰色并叠加透明度，节点标签固定在4到6号字体之间。这套组合不一定是最潮的，但一定是审稿人和编辑看着最舒服的，因为它的信息层级非常明确。

7. 把网络图用在文章里的经验

最后分享一下我多次投稿之后总结出来的经验。KEGG网络图在文章里出现的常见位置是结果部分的“通路富集与调控网络分析”小节，通常和气泡图配合使用。气泡图放在前面，展示整体富集格局；网络图放在后面，展示具体通路之间的关联和关键枢纽。

如果网络图是基因-通路二分图，配文里通常要指认几个核心节点。我会在结果描述里明确点出“某基因同时连接了X条通路，提示其可能作为……”这样的句式。这种描述是审稿人最爱看到的，因为它把一个网络拓扑特征转化为可检验的生物学假说。如果你做的是通路-通路共享网络，配文里就要聚焦“共享基因数最高的通路对”，说明它们在同一生物过程中扮演什么角色。

关于图注（legend）和图例说明，也值得花时间。KEGG网络图包含的信息维度多，如果图例里没有把节点类型、颜色含义、边的粗细含义写清楚，读者根本无法独立解读。我一般会在图例里分三行说明：节点颜色与形状、边宽度与透明度、节点大小映射的拓扑指标，缺一不可。

根据我实际操作中的体会，KEGG网络图真正难的地方并不是画出来，而是画完之后你能不能解释清楚每一个视觉元素代表的生物学含义。如果把做图当作了测量，把读图当作了终点，这张图就只是个装饰品。能顺着网络图讲出一个通路如何在条件间联动、哪个基因在中间起到连接作用、这个连接是否经得起验证，才是一张网络图最大的价值。